Vergleich klassisches Bestimmungsverfahren vs. genetische Verfahren für die Bewertung von Makrozoobenthos

Genetische Verfahren im biologischen Monitoring

Die Artenvielfalt und Artzusammensetzung spielt für die Bewertung der Qualität von Fließgewässern eine zentrale Rolle. Im Bewertungsverfahren nach Wasserrahmenrichtlinie (WRRL) wird die Bestimmungsarbeit klassisch durch die Erkennung artspezifischer morphologischer Merkmale vorgenommen. Morphologische Bestimmungsarbeiten erfordern eine intensive Einarbeitung und viel Erfahrung und können bei schwer bestimmbaren Arten sehr zeitaufwendig sein. Nicht immer ist für alle Entwicklungsstadien eine eindeutige Artbestimmung anhand morphologischer Merkmale möglich. Genetische Verfahren ermöglichen es, Taxa anhand der DNA-Sequenz eines bestimmten Markergens molekularbiologisch zu bestimmen. Die Anwendung von genetischen Verfahren zur Identifikation von Arten hat durch die Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierung (Next Generation Sequencing) , die eine schnelle Analyse von Umweltproben ermöglicht, in den letzten Jahren in verschiedensten Bereichen enorm an Bedeutung gewonnen. Auch für die Bewertungsverfahren für Oberflächengewässer nach WRRL könnten die Fortschritte der genetischen Verfahren eine große Bereicherung sein, um Proben schnell und standardisiert zu analysieren. Vor diesem Hintergrund stellt sich die Frage, ob die aktuellen genetischen Verfahren bereits heute das Potential haben, das klassische Bewertungsverfahren gemäß Wasserrahmenrichtlinie in Hinblick auf die Makrozoobenthos (MZB) Bewertung für Fließgewässer zu optimieren bzw. zu ergänzen oder diese langfristig eventuell sogar zu ersetzen.

Wie wurden die Verfahren verglichen?

Um die Verfahren zu vergleichen, wurden im Rahmen dieser Studie für das LfU-Projekt "Monitoring Biologie – Anpassung an neue Herausforderungen" insgesamt 60 von der bayerischen Wasserwirtschaft erhobene und klassisch (morphologisch) bestimmte Makrozoobenthos Proben aus verschiedenen Fließgewässertypen mittels DNA Metabarcoding analysiert. Der Vorteil von Metabarcoding besteht darin, dass einzelne Arten aus einer Organismus Sammelprobe identifiziert werden können. Dazu wird die DNA aus der Sammelprobe extrahiert, das spezifische taxonomische Markergen für Makrozoobenthos mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt und durch Hochdurchsatz-Sequenzierung sequenziert. Diese Gensequenzen werden anschließend entsprechend ihrer DNA Sequenz Ähnlichkeit zu sogenannten OTUs (Operational taxonomic units) gruppiert. Diese OTU-Cluster werden schließlich mit Gensequenzen in Referenzdatenbanken (z.B. Barcode Of Life Database (BOLD)) verglichen und taxonomisch zugeordnet (Bioinformatische Auswertung). Anschließend wurden die morphologisch bestimmten Befunde mit den genetisch erstellten Befunden verglichen. Die jeweils aus den Befundlisten resultierenden Bewertungsergebnisse (1: sehr gut, 2: gut, 3: mäßig, 4: unbefriedigend oder 5: schlecht) der Module "Saprobie" und "Allgemeine Degradation" , sowie der Gesamtbewertung der biologischen Qualitätskomponente Makrozoobenthos wurden ebenfalls verglichen. Eine Übersicht des methodischen Vorgehens ist in Abbildung 1 dargestellt.

Erläuterung in nachfolgender Textdatei. Abbildung 1: Übersicht des methodischen Vorgehens. Makrozoobenthos (MZB) Proben aus dem biologischen Monitoring wurden morphologisch bestimmt und mittels Metabarcoding genetisch analysiert. Das Metabarcoding umfasst dabei die Extraktion der DNA des spezifischen Markergens und deren Vervielfältigung mittels Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction (PCR)) (Probenprozessierung). Die anschließende Sequenzierung und die abschließende taxonomische Zuordnung der gruppierten OTUs (operational taxonomic units) erfolgt über einen Abgleich der Sequenzen mit den in Referenzdatenbanken hinterlegten Sequenzen (bioinformatische Auswertung). Die daraus resultierenden Taxalisten und Bewertungsergebnisse (MZB Zustandsklasse) wurden anschließend miteinander verglichen.

Ist das Bestimmungsniveau vergleichbar?

Bei der Kontrolle der Ausbeute und Qualität der DNA hat sich gezeigt, dass die DNA einiger Proben stark degradiert war. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit einer standardisierten und hinsichtlich DNA Konservierung optimierten Anleitung für die Probenahme und Handhabung. Nichtsdestotrotz zeigt der direkte Vergleich der morphologisch bestimmten und genetisch erstelltenTaxalisten, dass die Übereinstimmung besonders auf Gattungs- und Familienniveau hoch ist (Art: 61%, Gattung: 69%, Familie 78%, Ordnung 66%) (Abbildung 2). Von den morphologisch bestimmten Arten war die Wiederfindungsquote in den genetischen Befunden bei den Gliederfüßern (Arthropoda) am höchsten (70 %), gefolgt von den Ringelwürmern (Annelida) (41%). Bei den Weichtieren (Mollusca) wurde die geringste Übereinstimmung (24 %) zwischen den Verfahren erzielt, wohingegen Plattwürmer (Plathelminthes) genetisch nicht nachgewiesen wurden (Abbildung 3). Von den Gliederfüßern wurden deutlich mehr Taxa genetisch identifiziert als morphologisch bestimmt. Dies betrifft insbesondere Arten aus der Familie der Zuckmücken (Chironomidae), die morphologisch im Larvenstadium nicht oder nur schwer bestimmt werden können (Abbildung 4b). Unter den ausschließlich morphologisch identifizierten Taxa befinden sich vor allem Taxa der Köcherfliegen (Trichoptera) und Eintagsfliegen (Ephemeroptera), die genetisch nicht nachgewiesen wurden (Abbildung 4a). Dies könnte ein Indiz für Fehlerquellen im morphologischen Bestimmungsverfahren sein oder auf Schwächen im genetischen Verfahren hinweisen. Die Qualität der Artidentifizierung und Wiederfindung ist von den hinterlegten Referenzen der verfügbaren Datenbanken abhängig und wird von Informationslücken und Fehlerquellen beeinträchtigt. So konnten zum Zeitpunkt dieser Studie wenige Arten nicht eindeutig zugeordnet werden, da der Artname in der Referenzdatenbank nicht hinterlegt war. Auch falsch bestimmte Arten in der Referenzdatenbank können die Ergebnisse der genetischen Verfahren beeinflussen. Bei genetisch sehr ähnlichen Arten besteht zudem eine hohe Verwechslungsgefahr.

Erläuterung in nachfolgender Textdatei. Abbildung 2: Übersicht der ausschließlich und gemeinsam morphologisch bestimmten (grün) und genetisch detektierten (blau) Taxa auf Art-, Gattungs-, Familien- und Ordnungslevel
Erläuterung in nachfolgender Textdatei. Abbildung 3: Anteile der ausschließlich und gemeinsam morphologisch (grün) und genetisch (blau) identifizierten Taxa der Klassen Annelida, Arthropoda und Mollusca
Erläuterung in nachfolgender Textdatei. Abbildung 4: Anteile (>1%) der ausschließlich morphologisch bestimmten (a, grün) und genetisch detektierten (b, blau) Taxa der entsprechenden Klassen (links) und die jeweils ermittelten Ordnungen der Klasse der Insecta (Mitte). Die Familien der jeweils ausschließlich morphologisch bestimmten Taxa der Ordnung Trichoptera (a, grün) und der ausschließlich genetisch detektierten Taxa der Ordnung Diptera (b, blau) sind rechts dargestellt.

Ergeben sich Unterschiede in den Bewertungsergebnissen?

Durch genetische Verfahren können bislang keine Abundanzwerte (Anzahl der Individuen einer Art) der Taxa in der Probe ermittelt werden, so dass lediglich angegeben werden kann, ob ein bestimmtes Taxon in der Probe vorhanden ist (anstatt der Abundanz wird lediglich eine 1 für "anwesend" oder 0 für "nicht anwesend" angegeben). Folglich können Diskrepanzen in den Bewertungsergebnissen nicht nur durch Unterschiede zwischen den morphologischen und genetischen Befunden entstehen, sondern auch durch Berechnungen basierend auf Anwesenheitsdaten anstatt Abundanzwerte. Es wurden deshalb auch Berechnungen mit der morphologisch bestimmten Taxaliste durchgeführt , wobei die Abundanzwerte in dieser Liste durch eine 1 für "anwesend" oder eine 0 für "abwesend" ersetzt wurden (M01). Die Bewertungsergebnisse der klassischen (MA) und genetischen Verfahren (G) stimmen insgesamt gut überein, was die statistisch hoch signifikanten Korrelationen verdeutlichen (Abbildung 5).

Erläuterung in nachfolgender Textdatei. Abbildung 5: Streudiagramme (unterhalb der Diagonale) und Spearman-Korrelationskoeffizienten (oberhalb der Diagonale) der berechneten Bewertungsergebnisse der Makrozoobenthos Module "Saprobie" und "Allgemeine Degradation" basierend auf morphologisch und genetisch ermittelten Makrozoobenthos Befunden. Auf der Diagonalen sind die unterschiedlichen Berechnungsverfahren dargestellt (MA: Ergebnisse basieren auf Berechnung mit morphologisch bestimmten Taxalisten mit Abundanzwerten, M01: Ergebnisse basieren auf Berechnung mit morphologisch bestimmten Taxalisten mit An-/Abwesenheitsdaten, G: Ergebnisse basieren auf Berechnung mit genetisch erstellten Taxalisten mit An-/Abwesenheitsdaten). Statistisch hoch signifikante Korrelationen sind durch *** gekennzeichnet.
Erläuterung in nachfolgender Textdatei. Abbildung 6: Verteilung der Bewertungsergebnisse (Zustandsklassen 1: sehr gut bis 5: schlecht) der unterschiedlichen Verfahren für die Gesamtbewertung der biologischen Qualitätskomponente Makrozoobenthos (MZB) und für die MZB Teilmodule "Allgemeine Degradation" und "Saprobie" (MA: Ergebnisse basieren auf Berechnung mit morphologisch bestimmten Taxalisten mit Abundanzwerten, M01: Ergebnisse basieren auf Berechnung mit morphologisch bestimmten Taxalisten mit An-/Abwesenheitsdaten, G: Ergebnisse basieren auf Berechnung mit genetisch erstellten Taxalisten mit An-/Abwesenheitsdaten). In den Säulen sind die prozentualen Anteile der Ergebnisse für die jeweilige Zustandsklasse dargestellt.

Betrachtet man die Gesamtbewertung Makrozoobenthos (MZB ZK), erzielten die genetischen Verfahren mehrheitlich mit dem klassischen Verfahren vergleichbare Ergebnisse (63%). Bei 20% bewertete das genetischen Verfahren schlechter und bei 17% besser als das morphologische Verfahren (Abbildung 7). Diskrepanzen zwischen den Bewertungsergebnissen basieren unter anderem darauf, dass wichtige Indikatorarten der Plathelminthes, die Strudelwürmer (Turbellaria), nicht und einige wichtige Indikatorarten der Weichtiere (Mollusca) nur eingeschränkt genetisch detektiert werden konnten.

Erläuterung in nachfolgender Textdatei. Abbildung 7: Darstellung der Zustandsklassenänderungen, die sich durch den Ersatz des klassischen Bewertungsverfahrens (Berechnungen mit morphologisch bestimmten Befunden inklusive Abundanzwerte) durch genetische Verfahren (Berechnungen mit genetisch ermittelten Befunden mit An-/Abwesenheitsdaten) für die biologische Qualitätskomponente Makrozoobenthos und die Teilmodule "Allgemeine Degradation" und "Saprobie" ergeben. In den Säulen sind die prozentualen Anteile der jeweiligen Zustandsklassenänderungen dargestellt.

Fazit – Was sind die Potentiale und Schwächen genetischer Verfahren?

Die wesentlich höher genetisch detektierte Artauflösung für einige Artgruppen und die hoch signifikanten Korrelationen der Bewertungsergebnisse zeigen das Potential genetischer Verfahren auf, klassische Verfahren der morphologischen Bestimmung zu komplettieren bzw. zu ergänzen. Die deutlichen Abweichungen in den Taxalisten, die auch Auswirkungen auf die Bewertungsergebnisse haben, zeigen jedoch, dass genetische Verfahren das klassische Verfahren gegenwärtig nicht ersetzen können. Dies basiert auf einigen Schwächen im genetischen Verfahren, die zukünftig adressiert werden sollten, um die genetische Wiederfindung der Taxa in den Proben weiter zu verbessern. Ein für den Erfolg der Artwiederfindung essentieller und kritischer Arbeitsschritt ist die DNA Konservierung. Hier besteht die Notwendigkeit einer standardisierten und hinsichtlich DNA Konservierung optimierten Anleitung für die Probenahme und Handhabung. Um möglichst das gesamte Taxaspektrum der Probe genetisch abbilden zu können, muss die Wahl der entsprechenden Markergene und der Primer an die zu detektierenden Organismengruppen spezifisch angepasst werden. Die Integration von räumlichen Verbreitungsmustern der Taxa in die automatisierte taxonomische Zuordnung könnte die Genauigkeit der taxonomischen Zuordnung von genetisch sehr ähnlichen Taxa erhöhen. Die durch genetische Verfahren erzielte höhere Artauflösung für spezifische Taxagruppen steigert zwar den Informationsgewinn, für die Gewässerbewertung ist diese höhere Artauflösung allerdings nur im Zusammenhang mit entsprechenden autökologischen Informationen gewinnbringend. Daher sind weitere Forschungsarbeiten hinsichtlich autökologischer Informationen und möglicher Indikatorpotentiale der genetisch detektierten Taxa sowie die entsprechende Anpassung der Taxaliste der Gewässerorganismen Deutschlands und der operationellen Taxaliste notwendig. Für eine optimale Integration der genetischen Methoden in das klassische Bewertungsverfahren ist zudem eine Strategie mit dem Umgang fehlender Abundanzwerte und eine fortlaufende Aktualisierung und Qualitätssicherung der Referenzdatenbanken unerlässlich.

Ausblick – was sind die nächsten Schritte?

Für einen weiteren Erkenntnisgewinn und für die Optimierung des genetischen Verfahrens für die Anwendung in der behördlichen Praxis beteiligt sich das LfU neben dem Eco-Alps Water Projekt auch an dem UBA GeDNA-Projekt (Projektlaufzeit 2019-2022) (gednaprojekt.wordpress.com). In diesem Projekt werden von der Universität Duisburg-Essen neben Makrozoobenthos- auch Phytobenthos Proben der Fließgewässertypen 5 und 9 (silikatische Mittelgebirgsbäche und –Flüsse) aus Sachsen, Nordrhein-Westfalen und Bayern genetisch analysiert. Zusätzlich wird auch die biologische Qualitätskomponente "Fischfauna" mittels Umwelt- oder environmental DNA (eDNA) untersucht. Neben dem Vergleich der Taxalisten und Bewertungsergebnisse sollen in dem GeDNA Projekt außerdem Korrekturfaktoren für die Gewässerbewertung aufgrund genetischer Erkenntnisse abgeleitet werden. Des Weiteren soll der genetisch basierte Erkenntnisgewinn interkalibriert und in die existierende Bewertungssoftware integriert werden.