DNA-Differenzierung

Es gibt keine zwei identischen Lebewesen auf der Welt, sogar eineiige Zwillinge weisen in ihrer DNS(engl. DNA) gewisse Unterschiede auf. Die DNS-Differenzierung sucht nach solchen Unterschieden. Die mit Hilfe der PCR vermehrten DNS-Abschnitte können aufgrund der Länge (Molekülgröße) und/oder der chemischen Zusammensetzung der Bauteile differenziert, d.h. unterschieden werden.

Gelelektrophorese

Mit der Gelelektrophorese erfolgt eine Auftrennung der DNS nach der Molekülgröße. Die DNS-Moleküle wandern innerhalb eines elektrischen Feldes vom negativen zum positiven Pol. Daher können DNS-Abschnitte, die durch PCR oder Restriktionsenzyme erzeugt wurden, innerhalb eines Trägermaterials (z.B. Agarose- oder Polyacrylamidgele) mittels Gelelektrophorese nach ihrer Molekülgröße aufgetrennt werden.

Station zur Durchführung der Gelelektrophorese Bild vergrößern Station zur Durchführung der Gelelektrophorese
Auftrennung von DNA-Bruchstücken (blau) Bild vergrößern Auftrennung von DNA-Bruchstücken (blau)

Kleine Stücke können schneller durch die Poren des Gels wandern, größere werden zurückgehalten. Nach Anfärben des Gels mit Ethidiumbromid fluoresziert die DNS unter UV-Licht. Neben der zu analysierenden DNS werden auch Bruchstücke mit bekannter Größe auf das Gel aufgetragen. Durch Vergleich mit dem Größenstandard bekannter Zusammensetzung kann die DNS-Länge (Anzahl der Basenpaare) der Probe angegeben werden.

Ergebnis der Gelelektrophorese. Die nach Molekülgröße aufgetrennten DNA-Bruchstücke werden im UV-Licht als Banden sichtbar. Durch den Vergleich mit einem Größenstandard können die einzelnen Banden nach deren „Länge“ quantifiziert werden. Bild vergrößern Ergebnis der Gelelektrophorese. Die nach Molekülgröße aufgetrennten DNA-Bruchstücke werden im UV-Licht als Banden sichtbar. Durch den Vergleich mit einem Größenstandard können die einzelnen Banden nach deren „Länge“ quantifiziert werden.

DGGE

Die „Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese“ (DGGE) gibt neben der Aussage über die Länge einer DNS auch Hinweise auf Veränderung der Basenzusammensetzung innerhalb der Bruchstücke. Das ist relevant beim Auffinden von Mutationen und bei der Unterscheidung von Arten bzw. Individuen. Die mittels PCR vervielfältigten DNS-Fragmente von Referenz-DNS und zu untersuchender Probe werden gemischt und durch vorsichtiges Erhitzen und Abkühlen getrennt und wieder zusammengelagert. Dabei bilden sich auch sogenannte Chimären, die aus DNS von zwei verschiedenen Organismen (Referenz und Probe) bestehen. Je ähnlicher die beiden Hälften sind, umso stabiler ist die Verbindung. Ähnlich wie unter Hitzeeinwirkung trennen sich die Doppelstränge der DNS auch durch höhere Konzentration bestimmter Salze. Diese Eigenschaft wird in der DGGE genutzt: das DGGE-Gel wird so hergestellt, dass am negativen Pol die Salzkonzentration niedriger ist als am positiven Pol. Während die DNS im elektrischen Feld wandert, teilt sie sich durch den Salzgradienten langsam in Einzelstränge auf. Diese unterscheiden sich nach Anfärben von den intakten Doppelsträngen.. Durch geeignete Versuchsbedingungen können Abweichungen von weniger als 1% detektiert werden. Die DGGE ist also eine Kombination aus physikalischer und chemischer Auftrennung der DNA-Bruchstücke.